免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。今天上海恒遠(yuǎn)為大家整理了一些一些免疫組化的常見問題，下面我們來看看吧！

 1.在什么情況下使用TritonX-100？

(1)Triton X-100 化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um 厚切片)和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。

(2)其作用原理：Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。

(3)Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用

2.封閉血清的選擇原則是什么？

(1)膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！(2)封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會造成背景。(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

3.抗體孵育條件的比較？

(1)一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果→佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37 度 1-2 h，而4度夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45 min。(2)二抗一般室溫或 37 度 30 min-1 h，具體時間需要摸索。

4.一抗 4 度孵育后為什么要進(jìn)行 37 度復(fù)溫？

(1)一方面，防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片；(2)另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要, 但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 度和 37 度時分子運動方式不同, 前者分子碰撞機率和運動速度小于后者, 后者結(jié)合更快, 但敏感性也提高了并易造成非特異染色。(3)其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟片子從 4 度夜拿出后，直接用 PBS 洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實勝于雄辯！ 

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