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大鼠褪黑素(MT)ELISA實驗說明

更新時間:2025-06-06   點擊次數(shù):156次

檢測范圍                                                        

1.5ng/L-48ng/L


使用目的

本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中褪黑素(MT)含量。

 

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠褪黑素(MT)水平。用純化的大鼠褪黑素(MT)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入褪黑素(MT),再與HRP標(biāo)記的褪黑素(MT)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的褪黑素(MT)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠褪黑素(MT)濃度。

 

標(biāo)本要求 

1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

 

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

48ng/L

5號標(biāo)準(zhǔn)品

150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

24ng/L

4號標(biāo)準(zhǔn)品

150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

12ng/L

3號標(biāo)準(zhǔn)品

150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

6ng/L

2號標(biāo)準(zhǔn)品

150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3ng/L

1號標(biāo)準(zhǔn)品

150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

 

2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。

7. 溫育:操作同3。

8. 洗滌:操作同5。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

11. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。


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