什么是間接凝集反應

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關的顆粒載體上，然后與相應的抗體結合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應。間接凝集反應比直接凝集反應敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。本實驗介紹了間接凝集反應兩種主要方法：間接血球凝集試驗、間接凝集抑制試驗和協(xié)同凝集試驗。

實驗原理
1. 間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應的抗血清相遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。
間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。
2. 若使可溶性抗原與相應抗體先混合，充分作用后再加入有關的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。妊娠試驗：孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發(fā)生抗原抗體反應的結果，抗體被消耗，此時再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒）。不發(fā)生反應，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結合發(fā)生反應。出現(xiàn)均勻細小顆粒，妊娠試驗為陰性。
3. 金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體的Fc段結合。IgG的Fe段與SpA結合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其與特異性抗原相遇時，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應中，金黃色葡萄球菌菌體成了IgG抗體的載體,稱為協(xié)同凝集反應.本反應也可用于檢測微量抗原。
實驗步驟
間接血球凝集試驗：
材料：
1．抗原—傷寒桿菌O抗原
2．免疫血清：傷寒桿菌O901免疫兔血清
3．25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等
方法：
1．“O”抗原的制備：
將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。
2．致敏紅血球懸液制備：
取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經(jīng)2小時。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，而配制成0.5%懸液即成。
3．試驗步驟：
1） 小試管9只標好號碼于試管架上。
2） 第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。
3） 以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9管不加血清作對照。
4） 于每管加入0.5毫升已經(jīng)致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放入37℃水浴中2小時后觀察結果。凡zui高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現(xiàn)*血凝者，即為該血清的間接血清效價。
間接凝集抑制試驗：
材料：
1．抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原
2．抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清
3．被檢材料：孕婦尿
4．正常尿作對照用
5．黑反應板1塊
6．滴管3只
方法：
1．用清潔滴管在反應板上滴加一滴被檢尿。
2．再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。
3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀察結果。出現(xiàn)均勻一致的細小顆粒為陰性反應，懷孕。
注意事項：
1．試驗材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）
2．被檢尿太混濁，需要小心過濾。
3．尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。
協(xié)同凝集試驗
材料：
1. 抗原:可溶性傷寒桿菌O抗原
2. 免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清
3. 10%CoWan1株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液
4. PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等
方法：
1．10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWan1株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)18-24小時，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉速度離心20分鐘。沉淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室溫中固定3小時。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。
2．致敏葡萄球菌：
1毫升10%的菌懸液加0.1毫升傷寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分鐘（中間需搖動兩次）。取出后經(jīng)每分鐘2500轉速度離心20分鐘，棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。
3．協(xié)同凝集試驗
1） 取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內即可發(fā)生凝集。
2） 滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒O菌培養(yǎng)物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無凝集。
3） 用傷寒“O”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養(yǎng)物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應，不出現(xiàn)凝集。